Composé sur le Psaume 50 en 1638 et que l'on continue à chanter chaque année à la Chapelle Sixtine pendant la Semaine sainte. Traité en faux-bourdon, le Miserere est écrit pour deux chœurs, l'un à quatre voix, et l'autre à cinq. L'un des chœurs chante une version simple de la psalmodie et l'autre chœur, à quelque distance (comme en écho), en chante un commentaire orné. C'est un des meilleurs exemples du style polyphonique de la Renaissance désigné au xviie siècle comme stile antico ou prima prattica, et on peut y relever les influences combinées des écoles romaine (Palestrina) et vénitienne (les Gabrieli, le double chœur).
Le Miserere d'Allegri est un des exemples de la polyphonie de la Renaissance qui ont été les plus favorisés par l'édition discographique, alors qu'il a été composé à l'époque baroque, quand cette polyphonie commençait à passer de mode. Cet ouvrage a conservé une réputation de mystère et d'inaccessibilité pendant les siècles écoulés depuis sa composition jusqu'à l'époque moderne. Avant tout, de par le caractère exceptionnel d'une méditation qui semble imiter les voix angéliques. Basée sur un schéma musical très simple et atteignant très régulièrement le suraigu, elle dégage un grand sentiment de pureté. Tout cela (et de superbes développements contrapuntiques non écrits, dont l'usage s'est malheureusement perdu aujourd'hui) pouvait - et peut toujours - toucher profondément l'auditeur. De ce fait, le Vatican s'en était réservé la reproduction et la diffusion. Mais en 1769, le jeune Mozart, alors âgé de quatorze ans, fit un voyage à Rome avec son père ; il entendit le Miserere d'Allegri à deux reprises et put en restituer la partition de mémoire (à la première ou seconde écoute, selon les sources). Cette restitution (qui ne pouvait pas reproduire les ornements improvisés, déjà largement tombés en désuétude) fut acquise et publiée en Angleterre par le Dr Burney, historien de la musique et voyageur renommé. L'éditeur de Leipzig Breitkopf & Härtel publia ensuite l'ensemble de la musique chantée à Rome pendant la Semaine Sainte, y compris le Miserere d'Allegri. Felix Mendelssohn-Bartholdy a témoigné dans une de ses lettres de l'impression extraordinaire causée par cette musique pendant les cérémonies.